細(xì)胞計(jì)數(shù)儀驗(yàn)證

1．細(xì)胞計(jì)數(shù)儀概述

細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是用來進(jìn)行細(xì)胞濃度檢測的儀器，目的是為了明確培養(yǎng)的細(xì)胞在某一時間段的密度，及時補(bǔ)充營養(yǎng)液，以便其能夠良好生長，一般以每毫升細(xì)胞數(shù)（細(xì)胞/ml）來表示計(jì)數(shù)結(jié)果。那么這就需要測量死細(xì)胞和活細(xì)胞的濃度，在細(xì)胞中，細(xì)胞死亡是正常的，總細(xì)胞數(shù)中活細(xì)胞所占的百分比稱為細(xì)胞活力，也可叫做存活率。對細(xì)胞活力的應(yīng)用可用于對復(fù)蘇后細(xì)胞凍存和復(fù)蘇效果的檢測，也可用于在組織中對細(xì)胞進(jìn)行分離時是否存在損傷的檢測。現(xiàn)在常用的對細(xì)胞死活的辨別方法是通過使用臺盼藍(lán)，臺盼藍(lán)染色的原理是活細(xì)胞不會被染色，而死細(xì)胞能夠染色，另一個是熒光染色法來鑒別。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀有兩個重要的功能，一個是計(jì)數(shù)，另一個就是對細(xì)胞是否死亡的判斷。目前市場上有兩類細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：一類是明場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀僅需簡單的臺盼藍(lán)染色，另一類是熒光場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，需要相應(yīng)的熒光染料。

2．細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的原理

(1)   臺盼藍(lán)染色原理（明場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）：臺盼藍(lán)是細(xì)胞跨膜染料，活細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，臺盼藍(lán)無法通過，細(xì)胞呈中心透亮具有明顯的輪廓。死細(xì)胞膜通透性改變，臺盼藍(lán)可跨過死細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞顏色加深，呈現(xiàn)實(shí)心的圓點(diǎn)與活細(xì)胞中心透亮輪廓清晰有明顯的差異，根據(jù)這種形態(tài)的差異可以明顯區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行區(qū)別計(jì)數(shù)。

(2)  AO/PI 熒光染色原理（暗場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）：AO/PI 為細(xì)胞核染料，AO 為吖啶橙是一種小分子染料，可以跨過所有細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使有核細(xì)胞標(biāo)記上綠色熒光。PI 是碘化丙啶一種大分子染料，只有細(xì)胞死亡膜通透性改變后才能跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞的核標(biāo)記上紅色熒光。AO/PI 染細(xì)胞后，死細(xì)胞會同時染上 AO 和 PI，AO 的發(fā)射光波長 532 nm 左右，PI 的激發(fā)光波長剛好與 AO 發(fā)射光波長相重，兩種染料同染上死細(xì)胞核時會發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，AO 的發(fā)射光被 PI 吸收，所以死細(xì)胞只會顯示紅色熒光，而活細(xì)胞只有綠色熒光。因此，通過特異性染色的細(xì)胞上標(biāo)記的紅色熒光和綠色熒光就可以快速辨別出死細(xì)胞和活細(xì)胞。

注：AO/PI試劑由可以發(fā)出綠色熒光的DNA結(jié)合染料吖啶橙（AcridineOrange，簡稱AO）和可以發(fā)出紅色熒光的DNA結(jié)合染料碘化丙啶（Propidiumiodide，簡稱PI）組成。

3．為什么細(xì)胞計(jì)數(shù)儀要做驗(yàn)證呢？

首先應(yīng)該明確做驗(yàn)證的目的，就是為了保證使用的儀器檢測出的結(jié)果數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可信。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是用來檢測細(xì)胞數(shù)目的儀器，對其準(zhǔn)確度要求很高，比如它的重復(fù)復(fù)現(xiàn)結(jié)果的能力、穩(wěn)定性等等。新儀器使用前以及儀器使用一段時間后都需要對其進(jìn)行驗(yàn)證，保證檢測細(xì)胞數(shù)目的結(jié)果準(zhǔn)確、可信，就必須對它的安裝、環(huán)境等各部分系統(tǒng)要求進(jìn)行驗(yàn)證，以證明該儀器符合檢測的目的和要求，產(chǎn)生的誤差也在規(guī)定范圍內(nèi)。那么儀器驗(yàn)證就是對儀器各功能進(jìn)行檢測、驗(yàn)證使其滿足使用者的要求。這就需要通過設(shè)計(jì)合理的預(yù)試驗(yàn)來驗(yàn)證該儀器是否符合檢測樣品的規(guī)定要求，復(fù)現(xiàn)性怎么樣、準(zhǔn)確度會不會有偏移，結(jié)果是否可信等。所以儀器驗(yàn)證就是為了保證所檢測出的結(jié)果是否可信、準(zhǔn)確，這是很有必要的，只有經(jīng)過驗(yàn)證的儀器，確保該儀器各部分都在良好的情況下才能用于細(xì)胞數(shù)目的檢測。

4．細(xì)胞計(jì)數(shù)儀驗(yàn)證項(xiàng)目

（1）安裝確認(rèn)

a.文件確認(rèn)

b.附件確認(rèn)

c.安裝環(huán)境確認(rèn)

d.安裝情況確認(rèn)

（2）運(yùn)行功能確認(rèn)

a.運(yùn)行功能確認(rèn)

b.軟件控制功能測試

（3）性能確認(rèn)

a. 準(zhǔn)確度測試

b. 線性關(guān)系測試

c. 重復(fù)性測試

d. 細(xì)胞活率判定測試

5．注意事項(xiàng)

(1 ) 每次使用前檢查檢出室或檢出器細(xì)孔是否被污染，檢出器細(xì)孔是否被損壞，細(xì)胞計(jì)數(shù)定量隔膜泵和檢出器之間的管道是否堵塞等；

(2) 取樣計(jì)數(shù)前，充分混勻細(xì)胞懸液，使分散成單個細(xì)胞；

(3)  如果感覺細(xì)胞數(shù)量較多時，可以從細(xì)胞懸液中吸取10μL至100μL，用少量PBS稀釋后再作計(jì)數(shù)；

(4) 上機(jī)前注意檢查是否有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中；

(5) 所用的稀釋器、吸樣管要經(jīng)過校準(zhǔn)；

(6) 檢測前試樣混勻很重要，如果無旋轉(zhuǎn)式混勻器應(yīng)顛倒混勻至少8次；

公司背景介紹：

澤恒.華譜在計(jì)量校準(zhǔn)、驗(yàn)證與確認(rèn)的優(yōu)勢是專注做生物制藥質(zhì)控服務(wù)，針對一些特殊的儀器都非常熟悉，核心團(tuán)隊(duì)來源于制藥公司和儀器廠家，對儀器和GMP法規(guī)都很熟悉，比如：我們團(tuán)隊(duì)專門研發(fā)了替代進(jìn)口的熒光定量PCR儀校準(zhǔn)裝置，大大降低熒光定量/定性PCR儀校準(zhǔn)的成本（遠(yuǎn)低于同行）；我們開發(fā)了細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的校準(zhǔn)內(nèi)部規(guī)程；開發(fā)了細(xì)胞復(fù)蘇儀的內(nèi)部校準(zhǔn)規(guī)程；開發(fā)了凝膠電泳掃描儀的校準(zhǔn)規(guī)程；我們開發(fā)了溫度驗(yàn)證所需要的超低溫和超高溫一體化無線探頭，降低用戶大量使用探頭時的成本，代替了進(jìn)口；這些例子還有很多，因?yàn)槲覀兌际巧锍錾恚晕覀冴P(guān)注每一個生物用戶工藝要求，在生物制藥儀器設(shè)備上面專注，“與質(zhì)量同行、做儀器設(shè)備質(zhì)控"，為了讓生物制藥更安全而努力。

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